2 研究背景  

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的首要病因，手術(shù)聯(lián)合化療/放療是標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但治療后耐藥頻發(fā)且機(jī)制未明。細(xì)胞毒療法在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)釋放大量損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），這些危險(xiǎn)信號(hào)雖可激活抗腫瘤免疫，卻也常誘導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境，最終削弱療效。近年來(lái)，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）及其DNA成分（NET-DNA）被證實(shí)參與腫瘤進(jìn)展，但其在化療/放療抵抗中的功能角色、臨床意義及上下游調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

現(xiàn)有靶向NET-DNA的策略（如DNase I降解）雖可抑制轉(zhuǎn)移，但存在非特異性切割DNA、損害宿主免疫防御等局限。因此，亟需明確治療誘導(dǎo)NET-DNA促進(jìn)耐藥的精確機(jī)制，并識(shí)別可干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。本研究假設(shè)NET-DNA通過特異性受體激活癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）程序從而降低治療敏感性，旨在闡明NET形成的上游驅(qū)動(dòng)信號(hào)及癌細(xì)胞感知NET-DNA的下游效應(yīng)通路，為開發(fā)精準(zhǔn)、低毒的聯(lián)合干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

2 研究結(jié)果  

1. 化療和放療促進(jìn)乳腺癌中NET的生成  

研究者首先對(duì)4T1移植瘤進(jìn)行scRNA-Seq，發(fā)現(xiàn)多柔比星（DOX）處理后瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞比例顯著升高，其轉(zhuǎn)錄特征顯示NET形成通路（NETosis）富集最明顯。免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證化療組瘤內(nèi)Ly6G+中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，且H3cit與MPO共定位的NET結(jié)構(gòu)增多，血清MPO-DNA復(fù)合物水平同步上升。該現(xiàn)象具有普適性：在激素受體陽(yáng)性MCF-7模型、HER2富集型MMTV-PyMT自發(fā)瘤模型以及接受新輔助化療的81例患者配對(duì)活檢標(biāo)本中，治療后NET表達(dá)均顯著上調(diào)。放療同樣提升瘤內(nèi)NET水平，且乳腺癌患者放療后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及Lewis肺癌公共數(shù)據(jù)均顯示中性粒細(xì)胞評(píng)分與NET通路增強(qiáng)。綜上，化療/放療通過激活NETosis程序，在原發(fā)瘤、轉(zhuǎn)移灶及外周血中系統(tǒng)性增加NET負(fù)荷。

2.NET生成增強(qiáng)削弱化療和放療療效  

通過公共數(shù)據(jù)集GSEA分析，耐藥腫瘤中NET形成通路顯著上調(diào)；對(duì)233例接受新輔助化療（NAC）的患者隊(duì)列進(jìn)行Kaplan-Meier分析，高NET組總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）均顯著縮短，多因素Cox回歸確認(rèn)其為獨(dú)立預(yù)后因子。功能上，DNase I降解NET-DNA或利用Pad4?/?小鼠（NET生成缺陷）聯(lián)合多柔比星/放療，使4T1和MCF-7模型腫瘤體積較單藥組再縮小40–60%，肺肝轉(zhuǎn)移灶減少>50%，凋亡指數(shù)提升2倍以上。臨床轉(zhuǎn)化層面，高NET患者對(duì)NAC客觀反應(yīng)率降低，且在HR+亞型中預(yù)后價(jià)值更突出。這些數(shù)據(jù)證實(shí)NET不僅是耐藥標(biāo)志物，更是可直接干預(yù)的功能性靶點(diǎn)。

3. 巨噬細(xì)胞來(lái)源的CXCL1/2和CFB在化療/放療下促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與NETosis

scRNA-Seq細(xì)胞通訊分析顯示巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞互作權(quán)重最強(qiáng)，空間定位顯示NET聚集于巨噬細(xì)胞富集區(qū)。清除巨噬細(xì)胞（抗CSF1R抗體或氯膦酸鹽）后，多柔比星誘導(dǎo)的Ly6G+細(xì)胞浸潤(rùn)和NET生成減少60%以上。機(jī)制上，化療后巨噬細(xì)胞CXCL1/2與補(bǔ)體因子B（CFB）表達(dá)上調(diào)3–5倍，CXCR2抑制劑SB225002或CFB抑制劑LNP023聯(lián)用使瘤內(nèi)NET下降55%和48%，腫瘤生長(zhǎng)分別再抑制42%與38%。Cxcr2^?/?和Cfb^?/?基因敲除小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證該通路必要性，且抑制該軸可減少肺/肝轉(zhuǎn)移灶形成。因此，巨噬細(xì)胞通過分泌CXCL1/2和CFB，構(gòu)成治療誘導(dǎo)NET擴(kuò)增的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)環(huán)路。

4. 巨噬細(xì)胞通過吞噬治療誘導(dǎo)的腫瘤碎片促進(jìn)CXCL1/2和CFB表達(dá)及NETosis  

scRNA-Seq顯示化療后巨噬細(xì)胞“吞噬體”和“FcγR介導(dǎo)的吞噬”通路富集，體內(nèi)成像證實(shí)Luci?/GFP?/PyMT?腫瘤碎片被F4/80?巨噬細(xì)胞吞噬比例增加2–3倍。體外實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤碎片刺激使骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）分泌CXCL1/2和CFB提升4–6倍，而細(xì)胞松弛素B（CytoB）抑制肌動(dòng)蛋白聚合或MerTK抑制劑UNC2250阻斷吞噬后，該效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)70%以上。體內(nèi)聯(lián)合UNC2250與化療，使瘤內(nèi)吞噬碎片巨噬細(xì)胞減少50%，NET密度同步下降，腫瘤生長(zhǎng)延緩。將腫瘤碎片與活細(xì)胞共注射可增強(qiáng)NET形成，證實(shí)碎片是激活巨噬細(xì)胞炎癥程序的危險(xiǎn)信號(hào)，從而橋接治療損傷與NET擴(kuò)增。

5. 腫瘤碎片中的CTSC蛋白在化療后促進(jìn)NETosis  

通過交叉篩選耐藥腫瘤與scRNA-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CTSC在兩者中均上調(diào)；敲低CTSC使碎片誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)降低60%以上。機(jī)制上，重組CTSC蛋白直接刺激巨噬細(xì)胞，通過TLR4/TRIF（而非MyD88）途徑促進(jìn)p65核轉(zhuǎn)位，激活NF-κB。TLR4與RAB5在早期內(nèi)體共定位，證實(shí)內(nèi)體TLR4識(shí)別CTSC。臨床數(shù)據(jù)支持其相關(guān)性：乳腺癌瘤內(nèi)CTSC表達(dá)高于正常組織，且高CTSC患者接受化療后生存期縮短。體內(nèi)敲低腫瘤細(xì)胞CTSC聯(lián)合化療，使瘤體積縮小55%，NET密度下降50%，從而確立CTSC為治療損傷感知與NET擴(kuò)增的關(guān)鍵介質(zhì)。

6. NET通過CCDC25促進(jìn)乳腺癌治療抵抗

臨床隊(duì)列分析顯示，瘤內(nèi)CCDC25高表達(dá)與HR+患者NAC后DFS/OS縮短及病理完全緩解率降低相關(guān)。體外NET刺激使CCDC25?的MCF-7和T47D細(xì)胞對(duì)多柔比星IC50升高，E-cadherin下降，Vimentin/N-cadherin增加，而敲除或中和CCDC25可逆轉(zhuǎn)EMT并恢復(fù)藥物敏感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCDC25敲除的MCF-7移植瘤或4T1模型在化療/放療下腫瘤體積分別縮小70%和50%，凋亡指數(shù)提升2.5倍，但瘤內(nèi)NET總量無(wú)變化，表明CCDC25作用位于NET下游。MMTV-PyMT模型中，抗CCDC25中和抗體聯(lián)合化療顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)及肺肝轉(zhuǎn)移，為靶向該受體提供直接證據(jù)。

7. NET-CCDC25相互作用通過STAT3激活和EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥  

RNA-Seq顯示NET處理后MCF-7細(xì)胞EMT通路富集度居首，且STAT3靶基因集同步上調(diào)。Pull-down/質(zhì)譜鑒定PKM2為CCDC25結(jié)合蛋白；NET刺激后PKM2核轉(zhuǎn)位增加，與STAT3 Tyr705磷酸化及TWIST1、SNAIL啟動(dòng)子結(jié)合呈正相關(guān)。CCDC25敲除使STAT3核結(jié)合能力下降。功能上，敲低STAT3或使用抑制劑Stattic可阻斷NET誘導(dǎo)的EMT標(biāo)志物轉(zhuǎn)換，并恢復(fù)MCF-7對(duì)多柔比星敏感性。PKM2抑制劑Shikonin阻止其核定位，也抑制STAT3磷酸化及EMT。因此，NET-DNA結(jié)合CCDC25后招募PKM2入核，進(jìn)而磷酸化STAT3，驅(qū)動(dòng)EMT轉(zhuǎn)錄程序，形成完整的“NET-CCDC25-PKM2-STAT3-EMT”耐藥軸。

2 研究結(jié)論  

化療和放療通過“腫瘤碎片→巨噬細(xì)胞吞噬CTSC→TLR4/TRIF/NF-κB→ CXCL1/2/CFB”信號(hào)級(jí)聯(lián)，顯著增加瘤內(nèi)及轉(zhuǎn)移灶的NET形成。釋放的NET-DNA與癌細(xì)胞膜受體CCDC25結(jié)合，經(jīng)PKM2介導(dǎo)STAT3磷酸化，激活EMT程序，導(dǎo)致乳腺癌尤其是HR+亞型對(duì)治療耐受。靶向阻斷CCDC25、CXCR2或CFB可在保留宿主免疫防御的同時(shí)，顯著增強(qiáng)化療/放療療效，為臨床克服耐藥提供了新的組合策略和可干預(yù)的生物標(biāo)志物。

Li H, Zhang Y, Lin J, Zeng J, Liang X, Xu L, Li J, Zhong X, Liu X, Liu Z, Yang X, Zhang Y, Wang S, Song E, Nie M, Yang L. Tumor-derived neutrophil extracellular trap-associated DNA impairs treatment efficacy in breast cancer via CCDC25-dependent epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2026 Jan 2;136(1):e190557. doi: 10.1172/JCI190557. PMID: 41480760; PMCID: PMC12721893.